按照四川省科技厅相关文件要求，我院检验科申报的省卫生厅科研项目《痰液细菌半定量培养新法（十二级法）探索》已完成，拟申报省州科技进步奖，现将科研课题情况公示如下：

　　一、项目名称：痰液细菌半定量培养新法（十二级法）探索（省卫生厅科研课题—编号080160）

　　二、完成单位：凉山彝族自治州第一人民医院

　　三、主要完成人：杨肇立 周 文 李俊如 李 键

　　　　　　　　　　任 萍 陈 旭 黄 静

　　四、课题完成情况

　　(一)立项背景：

　　国内外细菌培养方式有定性、定量和半定量三种。定性培养检验细菌的有无及种类，适用于非开放部位的无污染标本，譬如血液、脑脊液、浆膜腔或滑膜囊积液、闭合性脓肿穿刺液、下呼吸道保护性标本刷刷取物、肺泡灌洗液等。定量培养能比较准确地检验单位重量、体积或面积标本中的细菌数量，适用于均质性标本，譬如尿液、湿化瓶液、物表或手表清洗液、空气等。半定量培养只能比较粗略地检验标本内的细菌数量或相对数量，适用于开放部位的非均质性标本，譬如痰液、阴道/尿道分泌物、开放性伤口分泌物等。

　　自然咳出痰（甚至呼吸机吸痰）细菌学检验是医学检验的一道难题。因其难免受到上呼吸道正常菌群污染，感染性机会致病菌识别困难。有人主张只对直接采自下呼吸道的无污染标本（譬如保护性标本刷刷取物、肺泡灌洗液）进行细菌学检验，但患者和医生的认同性差。有人主张只对涂片内白细胞吞噬菌相对应的痰培养菌进行鉴定及药敏实验，但阳性率过低,尚未获得业内人士公允。因为吞噬菌只见于白细胞吞噬力大于细菌抗吞噬力的情况下，小于或等于均不发生。全国临床检验操作规程（1、2版）介绍的“四区划线法”判读细菌相对数量过于粗略，且操作因素影响大；其主张以“痰内机会致病菌半定量加号数量大于正常菌群代表菌草绿色链球菌或奈瑟菌加号数量”为筛检指针，阳性率亦低，临床反映不少下呼吸道细菌感染因培养阴性而难以用药。课题组曾设想对同一呼吸病患者同时进行口咽拭子和痰标本的细菌半定量培养，如果痰培养发现口咽拭子中没有的细菌或数量明显多于口咽的细菌，则可能来自下呼吸道，应予鉴定和药敏试验，却因大环境不支持而取消。  

　　因此，寻找一种判读细菌相对数量比较细致、感染性机会致病菌检出率及临床诊断符合率均较高而又切实可行的痰液细菌半定量培养新法，便成了临床微生物学检验人员面临的机遇和挑战。

　　(二)技术线路：

　　规范细菌学检验操作，严格室内质量控制和室间质量评价，保证检验结果准确可靠→借鉴白细胞分类计数方法，建立能够准确判读细菌相对数量的半定量培养新法，即“十二级法”→采用新法和传统“四区划线法”调查“健康人群”口咽部非厌氧菌携带率及携带量，运用比较鉴别原理，建立新法可疑感染性机会致病菌筛检指针→采用新旧两法对临床痰标本进行细菌半定量培养，比较其重复性、区分细菌相对数量的细致性和感染性机会致病菌检出率→统计新法检出的常见感染性机会致病菌的临床诊断符合率。

　　（三）研究成果：

　　1.建立新法——

　　借鉴白细胞分类计数方法建立判读细菌相对数量“十二级法”:3～5区划线接种，于菌落散在区域计数100个菌落中各种细菌的相对数量,若某菌0个，为（－）；计数区没有而非计数区存在但仅1～4个，为少量（<0.1）； 5～14个为0.1；15～24个为0.2；25～34个为0.3；余者类推；纯培养为1.0。运用比较鉴别方法，在“健康人群”口咽部非厌氧菌半定量调查的基础上制定可疑感染性机会致病菌筛检指针“与痰涂片白细胞内吞噬菌或胞外优势菌相对应的痰培养机会致病菌数量明显多于该菌口咽部正常携带平均数量”。

　　2.与旧法（四区划线法）做比较研究——

　　“四区划线法”:固定4区划线接种，只在1区生长为1+，1、2区均长为2+……4个区均长为4+；若痰内机会致病菌数量大于正常菌群代表菌草绿色链球菌和奈瑟菌数量，则给予鉴定并做药敏试验。

　　“十二级法”（新法）和“四区划线法”（旧法）区别——

　　 划线接种要求:新法1～多区（通常3～5）；旧法固定4区。

　　细菌相对数量判读分级：新法(-)、少量、0.1、0.2、0.3……1.0，12级；旧法（-）、（1+）、（2+）、（3+）、（4+），5级

　　 操作影响：新法较小，旧法较大。

　　重复性：新旧两法重复性均差，平均变异系数分别为22.45%和20.38%。

　　 区分细菌相对数量的细致性：“无呼吸道炎症人群”咽拭子培养，新法判读，非β－溶血性链球菌、奈瑟菌、凝固酶阴性葡萄球菌、G-杆菌和酵母样真菌的平均携带量分别为0.45、0.35、＜0.1、＜0.1和＜0.1，差别明显；旧法判读，却差别不大。

　　筛检阳性率比较：旧法以“痰内机会致病菌数量大于正常菌群代表菌草绿色链球菌和奈瑟菌数量”为筛检指针，阳性率5.92%（163/2754）；新法以“与痰涂片白细胞内吞噬菌或胞外优势菌相对应的痰培养机会致病菌数量明显多于该菌口咽部正常携带平均数量”为筛检指针，阳性率18.92%（521/2754）。

　　3.新法阳性菌的临床诊断符合率（疑似除外）：约50%～85%（铜绿76.6%、、肺克62.6%、大肠49.7%、表葡55.5%、鲍曼84.2%、念珠菌62.7%），菌量多少与临床诊断率高低成正比。。

　　4.结论：开放部位标本难免遭受正常菌群或环境菌污染，其病原学检查只能定位于“筛查”，不能作为诊断金标准,诊断应由医生按照现行公认标准做出；新法及其阳性筛检指针优于旧法，值得推广应用。

　　5.成果分量及质量：先后发表相关论文10篇，其中A类刊物9篇，B类1篇。

　　（四）发明点：

　　1. 细菌相对数量判读“十二级法”。

　　2. 痰液可疑感染性机会致病菌筛检指针。

　　（五）发现点：

　　1.“十二级法”和“四区划线法”的重复性、区分细菌相对数量的细致性及筛检阳性率。

　　2.“十二级法”检出的机会致病菌的口咽携带率、量、痰筛检菌量和诊断符合率:如下表

机会致病菌     口 咽 正 常 携 带                      痰筛检菌量 诊断符合率（%）

　　　　　平均携带率(%) 平均携带菌量

铜绿菌          G^-杆菌    33     ＜0.1                 ≥0.1               76.6

肺克菌          G^-杆菌    33     ＜0.1                 ≥0.1               62.6

大肠菌          G^-杆菌    33     ＜0.1                 ≥0.1               49.7

鲍曼菌          G^-杆菌    33     ＜0.1                 ≥0.1               84.2

表葡菌                    28     ＜0.1                 ≥0.1               55.5

念珠菌                     9     ＜0.1                 ≥0.1               62.7

　　注：菌量多少与临床诊断率成正比。

　　四川省医学情报研究所科技查新报告（编号2013303）证实：“国内未查见有相同的研究文献报道。”

　　（六）成果价值：

　　 十二级细菌半定量培养新法及其可疑感染性机会致病菌筛检指针不是尖端前沿，科技含量不高，但适用于各级各类医疗机构临床微生物学实验室。凉山彝族自治州第一人民医院常规应用17年，表明其有利于规范痰标本的细菌学检验，有效避免不同操作者之间的主观误差，提高痰标本可疑感染性机会致病菌检出率和诊断符合率，促进临床诊疗水平的提升。多个兄弟医院应用后，也有相似体会。    

　　（七）四川省医学情报研究所科技查新报告（编号2013303）结论：

　　1.国内已有委托查新课题组建立的痰液细菌半定量培养十二级法的临床应用研究文献报道。              

　　2.委托查新课题进行的痰液细菌半定量培养十二级法的制订、阳性筛检指针、临床诊断符合率及其与传统“四区划线法”的比较等研究，国内未查见有相同的研究文献报道。

　　四川省卫生厅组织函审鉴定（川卫科鉴字[2013]第13号）结论：

　　“该成果达到国内同类研究领先水平”。

　　以上内容公示期为三个月（2013.11.11—2014.2.11），各级人员如对以上公示内容有异议，请于公示期内与科教科联系，联系电话：0834-3246043。

凉山彝族自治州第一人民医院

2013年11月11日